Что такое ПЦР: полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция была открыто американцем Кэри Мюллисом в 1983 году. Перспективный метод диагностики инфекционных заболеваний принес ученому нобелевскую премию и стал одним из самых точных способов диагностики.

Объяснить неосвещенному человеку, что такое ПЦР будет очень непросто, но говоря коротко, процесс выглядит примерно так. Главная идея метода – значительно увеличить концентрацию какого-то определенного фрагмента ДНК в исследуемом материале. В конечном итоге, исследователь материал, которого достаточно для того, чтобы поставить диагноз. Главная «фишка» ПЦР в том, что копируется только тот участок, который подходит под заранее заданные критерии, и только в случае, если он есть в исследуемом материале. Тот факт, что метод подразумевает не только увеличение числа копий ДНК (которое называется амплификацией) , но и целый ряд иных действий с генетическим материалом, позволяет использовать ПЦР для клонирования генов, определения отцовства и целого ряда других задач, несвязанных с диагностикой инфекционных заболеваний.

С момента своего открытия, ПЦР стал эталонным методом диагностики целого ряда инфекционных заболеваний, который широко используется по всему миру. Применение этого метода позволяет диагностировать заболевание даже при наличии ничтожно малого числа молекул ДНК вируса, и все это без участия микробиологии, которая гораздо сложнее, что позволяет получать результат быстро. При всех этих достоинствах, точность метода не уступает, а зачастую даже превосходит большинство существующих аналогов.

Полимеразная цепная реакция позволяет выявлять возбудителей инфекций не только в анализах, полученных от больного. Метод позволяет проводить диагностику воды или почвы или многих других материалов внешней среды. Широкое распространение метод получил в урологии, где ПЦР применяется для диагностики вирусов папилломы человека, а так же для определения вирусных гепатитов B, C и G, и многих других вирусов.

Для проведения ПЦР требуется наличие амлификатора- специального аппарата, который циклически нагревает и охлаждает пробирки. Так же требуется высококипящее масло, которое предотвратит испарения реакционной смеси из пробирки во время процедуры и буферный раствор, который не даст им перемешаться. Так же нужна ДНК-матрица, с участком ДНК, подвергаемого исследованию, и целый ряд вспомогательных устройств. Стандартная процедура проведения ПЦР состоит из 25-30 циклов, разбитых на три стадии. Исследуемую ДНК-матрицу разогревают до 95 градусов, что обеспечивает разрушение цепей ДНК. Происходит денатурация – термическое разрушение водородной связи меду цепями. Иногда процедуре предшествует предварительный прогрев матрицы.

После того, как цепи разошлись, температуру понижают. Процедура называется отжигом. Температура отжига зависит от исследуемого материала, но, как правило, выбирается в интервале на 4-5°С ниже. Сем температура его плавления. Вся стадия занимает от полуминуты до двух.

Следующая стадия ПЦР называется элонгация. Подробно описывать ее здесь не будем, потому что придется использовать много специфических терминов малопонятных простым смертным. Отметим, что длительность этой стадии напрямую зависит от длины исследуемого фрагмента ДНК и обычно высчитывается по принципу одна минута на каждую тысячу пар оснований.

Несмотря на все свои преимущества ПЦР требует высокой подготовленности специалистов. Особенно важным является правильно взять материал для анализа у пациента, и корректно подготовить его. На сегодняшний день с этой задачей наиболее успешно справляются так называемые вакуумные системы, которые минимально травмируют пациента, и в тоже время позволяют получить материал так, чтобы он не контактировал с персоналом или внешней средой. Что важно для обеспечения объективности анализа ПЦР.

Неправильно организованная процедура взятия материала, устаревшее оборудование или халатность персонала, могут в итоге вызвать ложноположительный результат ПЦР, когда пациент узнает о положительном результате анализов, хотя сам он совершенно здоров. Помимо перечисленных причин, ложноположительный результат ПЦР возможет при следующих обстоятельствах.

Ложноположительный результат ПЦР возникает вследствие непопадания вматериал эпителиальных клеток, а содержания большого количества слизи, которая не несет информации, необходимой для диагностики.

Неверная транспортировка и хранение проб, которые предстоит анализировать, может стать одной из причин неверной диагностики. ДНК инфекции разрушаются, что приводит кложноположительному результату .

Недостаточная стерильность при проведении процедуры. При попадании в забранный материал микроорганизмов из внешней среды, может стать причиной того, что анализ покажет наличие несуществующей инфекции в организме больного.